Als Isaacs Mutter beginnt, Gottes Stimme zu hören, die ihr befiehlt, eine Opfergabe zu bringen, um ihren Glauben zu beweisen, flüchtet Isaac in den Keller, wo er Herden an geistesgestörten Gegnern, verlorenen Brüdern und Schwestern, seinen Ängsten und letztendlich seiner Mutter gegenüberstehen muss. The Binding of Isaac ist ein zufällig generierter Action-RPG-Shooter mit starken Rogue-like-Elementen. Bei Isaacs Reise werden die Spieler bizarre Schätze finden, die Isaacs Form verändern und ihm übermenschliche Fähigkeiten geben, die es ihm ermöglichen, die Scharen an mysteriösen Kreaturen zurückzuschlagen, Geheimnisse zu lüften und seinen Weg in die Sicherheit zu kämpfen.